明暗箱实验（Light/Dark Box Test，LDT）是一种用于测量小鼠焦虑样行为的经典实验方法，其核心原理是通过小鼠对明亮区域的本能厌恶与探索新环境的矛盾行为，量化其焦虑水平。 以下从实验方法、设备要求、操作步骤及注意事项四方面展开分析：一、实验方法与核心指标明暗箱实验基于小鼠对明亮环境的回避倾向（焦虑行为）与探索新环境的本能冲突。实验通过以下指标量化焦虑水平：进入暗室的潜伏期：小鼠从亮室首次进入暗室的时间，潜伏期越短，焦虑水平越低。亮室停留时间：小鼠在亮室中活动的总时长，时间越长，焦虑水平越低。转换次数：小鼠在亮室与暗室之间往返的次数，反映探索行为与焦虑的平衡。活动距离：小鼠在亮室中的移动距离，与探索行为相关。图1：明暗箱实验装置结构（亮室占2/3，暗室占1/3，通过3cm×4cm开口连接）二、实验设备与材料要求测试装置：盒子尺寸：42cm（长）×21cm（宽）×25cm（高），分为亮室（2/3）与暗室（1/3）。连接开口：3cm高、4cm宽，限制小鼠自由通过。光照控制：亮室光照强度200-400勒克斯（使用间接白光源），暗室≤5勒克斯（数字照度计校准）。辅助设备：摄像机：置于装置正上方，全程记录小鼠行为。分析工具：VisuTrack动物行为分析软件（上海欣软），可自动识别小鼠活动状态、轨迹及行为特征（如理毛、站立等）。实验材料：实验对象：实验室饲养的小鼠（每笼3-5只，12小时光照/黑暗循环，温度23°C，湿度可控，食物与水自由获取）。清洁用品：70%乙醇（用于清洁装置，避免气味干扰）。三、实验操作步骤环境准备：将实验装置置于隔离房间，远离噪音与干扰，使用低强度白光源。实验者避免发出噪音或使用气味强烈的产品（如香水）。小鼠适应：实验前将小鼠转移至行为测试室，适应至少30分钟。实验流程：用70%乙醇清洁亮室与暗室。将小鼠置于亮室中央，实验者远离装置并保持安静。允许小鼠自由活动5分钟，记录行为视频。实验后清理装置（去除尿液与粪便，再次用乙醇清洁并干燥）。数据分析：使用VisuTrack软件分析视频，提取潜伏期、停留时间、转换次数及活动距离等指标。图2：小鼠明暗箱实验样本数据（A.亮室停留时间；B.亮室活动距离；C.进入暗室潜伏期；D.转换次数）四、注意事项与改进要点实验版本差异：原始版本（Crawley等，1980）测试时间为10分钟，亮室墙壁透明；本实验改进为5分钟，亮室墙壁使用不透明白色塑料，更聚焦明亮空间焦虑的检测。小鼠选择：优先使用雄性小鼠，避免雌性发情周期对行为的影响。不同品系与年龄的小鼠基线活动可能存在差异，需在实验设计中控制变量。光照控制：使用间接光源避免阴影，防止小鼠因光照不均产生偏好。清洁与干燥：每次实验后彻底清洁装置，并确保完全干燥，避免乙醇气味残留影响小鼠行为。进入标准：仅当小鼠前爪及一半身体进入亮室或暗室时，才记录为“进入”；若返回原室，则不记录。VisuTrack软件可自定义进入区域的参数。软件功能利用：VisuTrack支持多种识别算法（如灰度法、动态背景法），可生成轨迹图、热图及活动量图，并分析精细行为（如理毛、摆头等）。软件包含GLP模块，支持用户权限管理、双盲实验及符合GLP标准的日志导出。五、实验优势与应用优势：无需预先训练小鼠，操作简便，结果可靠，对抗焦虑药物敏感。应用：广泛用于神经科学、药理学及行为学研究，评估药物对焦虑行为的影响或筛选抗焦虑化合物。通过严格遵循实验方法与注意事项，明暗箱实验可有效量化小鼠的焦虑样行为，为相关研究提供可靠数据支持。