转录组测序（bulk RNA-Seq）分析流程转录组测序（bulk RNA-Seq）分析是一个复杂但系统的过程，主要包括上游数据处理和下游数据分析两大阶段。以下是详细的分析流程：一、上游数据处理质量控制目的：对原始测序数据进行质量评估，确保数据的准确性和可靠性。检查内容：包括序列长度分布、测序错误率等关键指标。工具：使用fastqc和multiqc进行测序数据的质检，这些工具能够生成详细的质量报告，帮助识别潜在的数据问题。数据预处理目的：净化原始测序数据，去除可能影响后续分析的杂质。处理步骤：包括去除接头序列、去除低质量序列、去除含有未知碱基的序列等。工具：使用trim-galore等工具，这些工具能够高效地执行上述预处理步骤。比对目的：将预处理后的测序数据与参考基因组或转录组进行比对，以确定基因或转录本的表达量。工具：Hisat2等比对工具能够准确地将测序数据定位到参考基因组上，为后续的表达量计算提供基础。表达量矩阵目的：通过比对结果计算基因或转录本的表达量，得到基因表达量矩阵。工具：featureCounts等工具能够基于比对结果，统计每个基因或转录本的表达量，生成表达量矩阵。数据检查目的：检查数据的可靠性和不同分组的聚类情况。方式：通过样本hclust图、距离热图、PCA图、相关性热图等方法，对表达量矩阵进行可视化分析，以评估数据的可靠性和分组效果。二、下游数据分析差异表达分析目的：对比不同实验组或条件下的基因表达量，找出在不同样本中差异显著的基因或转录本。工具：DESeq2、edgeR、limma等工具能够基于表达量矩阵，进行差异表达分析，并输出差异表达基因列表。聚类和可视化目的：探索基因表达模式，并使用可视化方法展示转录组数据的特征和差异。表现：通过热图等方式展示基因表达模式，帮助研究人员理解不同样本间的基因表达差异。富集分析目的：对差异表达基因进行功能富集分析，找出与特定生物过程、通路或功能相关的基因。分析方法：GO富集分析：找出在特定生物过程、分子功能和细胞组分方面过度表示的基因。KEGG富集分析：找出在特定生物代谢途径和信号传导通路中过度表示的基因。GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）：基因集富集分析，用于评估特定基因集在表达谱中的富集程度。GSVA（Gene Set Variation Analysis）：从基因表达数据集中表征通路或特征摘要的技术。WGCNA（weighted gene co-expression network analysis）：权重基因共表达网络分析，将基因划分为不同的模块，以模块为单位进行分析。其他高级分析PPI蛋白互作网络：构建蛋白质相互作用网络，分析差异表达基因之间的相互作用关系。可变剪切（Alternative Splicing）：分析基因的可变剪切事件，了解基因表达的多样性。单核苷酸突变分析：检测基因中的单核苷酸突变，评估其对基因表达和功能的影响。转录本组装（Transcript Assembly）：基于测序数据组装转录本，获取更完整的基因表达信息。RNA编辑（RNA Editing）：检测RNA编辑事件，了解RNA分子在转录后修饰过程中的变化。融合基因（Fusion Gene）分析：检测融合基因，评估其在疾病发生和发展中的作用。APA（Alternative Polyadenylation）分析：分析基因的不同多聚腺苷酸化位点，了解基因表达的调控机制。circRNA（Circular RNA）分析：检测和分析circRNA，探索其在基因表达调控中的新功能。综上所述，转录组测序（bulk RNA-Seq）分析流程是一个复杂但系统的过程，涉及多个步骤和多种分析方法。通过这一流程，研究人员能够深入了解基因表达的变化和调控机制，为疾病研究、药物开发等领域提供有力的支持。