Western Blot是一种通过电泳分离蛋白质，并利用特异性抗体检测目标抗原的蛋白质检测技术，其显色方法主要包括放射自显影、底物化学发光ECL、底物荧光ECF和底物DAB呈色。Western Blot实验原理基本流程：Western Blot技术首先通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将细胞或组织总蛋白质按分子量大小分离，随后将分离后的蛋白质转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜NC膜或聚偏二氟乙烯膜PVDF膜）上。固相载体通过非共价键吸附蛋白质，同时保持其生物学活性。以转移后的蛋白质或多肽作为抗原，与特异性一抗结合，再通过标记的二抗（如酶或同位素）进行信号放大，最终通过显色反应检测目标蛋白。与Southern/Northern Blot的区别：检测对象：Southern Blot检测DNA，Northern Blot检测RNA，而Western Blot检测蛋白质。探针类型：Western Blot使用抗体作为“探针”，通过免疫反应特异性识别目标蛋白。显色机制：依赖标记二抗与底物的反应（如酶促显色或放射自显影）。核心原理：固相载体上的蛋白质保持电泳分离的多肽类型及活性，一抗特异性结合目标抗原，二抗通过标记物（如HRP）催化底物显色，实现目标蛋白的可视化检测。Western Blot显色方法放射自显影原理：使用放射性同位素（如32P）标记二抗，通过X光胶片曝光显示信号。特点：灵敏度高，但需处理放射性物质，存在安全风险，操作复杂。底物化学发光ECL（Enhanced Chemiluminescence）原理：二抗标记辣根过氧化物酶（HRP），催化过氧化物与鲁米诺反应发光，胶片曝光后洗出条带。特点：优势：灵敏度高、操作简便，试剂盒现成可用，适用于发表文章。应用：当前最常用的显色方法，尤其适合低丰度蛋白检测。反应式：HRP + 过氧化物 + 鲁米诺 → 发光 → 胶片曝光。底物荧光ECF（Enhanced Chemifluorescence）原理：二抗标记荧光物质，通过荧光信号检测目标蛋白。特点：无需胶片，但需荧光成像系统，灵敏度较高，但应用不如ECL广泛。底物DAB呈色原理：二抗标记HRP，催化3,3'-二氨基联苯胺（DAB）生成棕色沉淀。特点：优势：操作简单，结果直观，适用于常规实验。局限：灵敏度低于ECL，且DAB为潜在致癌物，需注意防护。显色方法对比与选择常用方法：底物化学发光ECL和底物DAB呈色。ECL：推荐用于高水平实验或发表文章，因灵敏度高、背景低。DAB：适用于基础实验或条件有限的情况，操作简便但灵敏度有限。其他方法：放射自显影因安全性问题逐渐被淘汰；ECF需特殊设备，应用较少。实验操作要点ECL显色步骤：孵育HRP标记的二抗。加入ECL反应液（过氧化物+鲁米诺）。胶片曝光，显影定影后获取条带。DAB显色步骤：孵育HRP标记的二抗。加入DAB底物溶液，观察颜色变化（棕色沉淀）。终止反应，记录结果。总结Western Blot通过电泳分离与抗体免疫反应实现蛋白质检测，显色方法中ECL和DAB最为常用。ECL因高灵敏度和简便性成为首选，尤其适用于科研发表；DAB则适合常规检测。实验选择需综合考虑灵敏度、操作难度及安全因素。